細菌とファージテンプレート

1999年以来、GENEWIZはサンガーシーケンシングプロセスを簡素化してゲノム研究を促進してきました。当社のローリングサークル増幅(RCA)サービスでは、プラスミドを調製することなく、細菌クローンまたはファージサンプルのシーケンシングを実施することができます。 RCAによってランダム六量体が環状テンプレートとプライミングすることで、シーケンシング用のDNAが生成されます。GENEWIZのRCAプロトコルのもとでは、あらゆるサイズのシーケンシングプロジェクトの処理が可能であり、また、細菌クローン(コロニーおよびグリセロールストック)およびファージサンプル(プラークまたは上清)双方から高品質のリードが生成されるよう最適化されています。またRCAは、少量のDNA出発物質しか用意できない場合(低コピー数プラスミドなど)に極めて高い効果を発揮します。

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ローリングサークル増幅(RCA)による細菌とファージのシーケンシング

RCAは自然界におけるDNA複製メカニズムとして認識されており、プラスミドおよびウイルスの伝搬において頻繁に用いられています。ランダム六量体が鎖と結合してDNAポリメラーゼが置換されると、サーマルサイクリングを実施せずに、多くの連結テンプレートコピーが生成されます(Dean et al., 2001)。合成された鎖は1回のRCAを経て置き換えられるため、後続のプライマー結合において再利用できます。双方のテンプレート鎖を相補するプライマーがRCA反応に含まれていれば、指数関数的増幅が実現します。

RCAプロセス

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溶解の後、細菌サンプルはdNTP、ポリメラーゼ、ランダム六量体と結合されます。六量体は環状テンプレートにアニールされ、複製が多くの部位で同時に始まります。
ここでは、高い安定性、処理性、忠実性を持つポリメラーゼが活用されています。これにより、複数回の増幅作業にわたって鎖の移動を持続させることができます。
新たに合成された鎖が移動することで生じる連続的なプライマー反応により、テンプレートが指数関数的に増幅します。
完了すれば、サンプルをいつでもサンガーシーケンシングにかけることができます。

RCAについては、シーケンシングの納期が24時間延長されることをご了承ください。 RCAは、長さが15 kb未満の環状テンプレートに対して推奨されています。

Dean, Frank B. et al. “Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.” Genome Research 11.6 (2001):1095–1099.

特徴と利点

時間と費用の節約:培養とDNA調製を行う必要はもうありません
&Phred20リードで600を超える塩基数
プロジェクトの設計とコンサルティング
ABI Prism 3730xl DNAアナライザーを用いた解析
短い納期
GENEWIZオンライン注文 / データ抽出システム:365日24時間利用できるウェブベースシステム
カスタムトラブルシューティング

用途

shRNAクローニングとライブラリースクリーニング:プラスミド調製物と配列コロニーを直接除去します。

DNAメチル化解析:PCR産物を直接クローニングし、細菌コロニーのシーケンシングを行うことで、時間を節約しつつ高品質のリードを取得できます。

抗体ファージディスプレイライブラリーの検証:直接的ファージシーケンシングにより、すばやいスクリーニングと検証が可能です。

サンプル提出オプション

サンプル提出オプション

グリセロールストック* サンプルを1.5 mlチューブまたは96ウェルプレートに入れて、ドライアイスを添えてお送りください。培地の種類を記してください。
細菌コロニー* コロニーを寒天プレートの上で格子状に配列させ、シーケンシングが必要なコロニーを丸で囲みます。それぞれのコロニーに番号を付けます。番号が付けられていないプレートはランダムで選択・処理されます。液体培養を使用する場合、サンプルを96ウェルプレートに入れ、ストリップキャップを付けて提出してください。寒天プレートをパラフィルムで巻き、損傷の可能性を防ぐため緩衝材を入れます。
ファージ上清** 50 ulのファージ上清を8連PCRチューブまたは1.5 mlマイクロチューブに入れ、サンプル名をはっきりと記してください。
ファージプラーク シーケンシング用に提出するプラークを丸で囲み、番号を付けます。輸送に際しては寒天プレートをパラフィルムで巻き、損傷の可能性を防ぐため緩衝材を入れます。

*注記:発現ベクターはRCAプロトコルには適さない場合もあります。

**注記:RCAは環状ファージに対してのみご利用になれます。線状ファージゲノムは、この方法では増幅できません。

当社のサンプル提出ガイドライン をご覧になり、細菌とファージのテンプレートに関する詳細を確認してください。

注文方法

*同日サービスをご利用になる場合、東部標準時(EST)の午前10時までにサンプルがGENEWIZニュージャージー研究所に届く必要があります。  直接的シーケンシングテンプレートについては、同日サービスはご利用になれません。



電子メール | 電話(048-483-4980)