大腸菌コロニーとファージ

ローリングサークル増幅(RCA)サービスでは、プラスミドを調製することなく、細菌クローンまたはファージサンプルのシーケンシングを実施することができます。 RCAの過程でランダム六量体が環状テンプレートとプライミングすることで、シーケンシング用のDNAが生成されます。RCAは、少量のプラスミドDNAしか用意できない場合(低コピー数プラスミド、あるいは大腸菌内で有害な配列を持つため調製が困難なプラスミドDNAなど)、もしくはプラスミドを下流の実験で必要としない実験で高い効果を発揮します。

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ローリングサークル増幅(RCA)による細菌とファージのシーケンシング

RCAは自然界におけるDNA複製メカニズムとして認識されており、プラスミドおよびウイルスの伝搬において頻繁に用いられています。ランダム六量体が鎖と結合してDNAポリメラーゼが置換されると、サーマルサイクリングを実施せずに、多くの連結テンプレートコピーが生成されます(Dean et al., 2001)。合成された鎖は1回のRCAを経て置き換えられるため、後続のプライマー結合において再利用できます。双方のテンプレート鎖を相補するプライマーがRCA反応に含まれていれば、指数関数的増幅が実現します。

RCAプロセス


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溶解の後、細菌サンプルはdNTP、ポリメラーゼ、ランダム六量体と結合されます。六量体は環状テンプレートにアニールされ、複製が多くの部位で同時に始まります。
ここでは、高い安定性、処理性、忠実性を持つポリメラーゼが活用されています。これにより、複数回の増幅作業にわたって鎖の移動を持続させることができます。
新たに合成された鎖が移動することで生じる連続的なプライマー反応により、テンプレートが指数関数的に増幅します。
完了すれば、サンプルをいつでもサンガーシーケンシングにかけることができます。

特徴と利点


AAVプラスミドにおける”Wild-type”および”partially-truncated ITR領域”の完全性に関する定量的評価
プロジェクトを通してレベルのカスタマーサポート
所要時間はわずか5営業日から
プロジェクトの設計とコンサルティング
点変異の早期検出 - リード長の増加とデータ品質の向上
簡便なサンプル提出 - DropBoxおよび配送業者(発送キットの無料配布 : お問合せはDNASeqJP@genewiz.comまで)
オンライン注文システム- 現在準備中。DNASeqJP@genewiz.comまでお問合せください。弊社スタッフがお客様アカウント内にご注文をご用意いたします。
カスタムトラブルシューティング

用途

shRNAクローニングとライブラリースクリーニング:プラスミド調製物と配列コロニーを直接除去します。

DNAメチル化解析:PCR産物を直接クローニングし、細菌コロニーのシーケンシングを行うことで、時間を節約しつつ高品質のリードを取得できます。

抗体ファージディスプレイライブラリーの検証:直接的ファージシーケンシングにより、すばやいスクリーニングと検証が可能です。

サンプル提出オプション

サンプル提出オプション

グリセロールストック* サンプルを1.5 mlチューブまたは96ウェルプレートに入れて、ドライアイスを添えてお送りください。培地の種類を記してください。
細菌コロニー* コロニーを寒天プレートの上で格子状に配列させ、シーケンシングが必要なコロニーを丸で囲みます。それぞれのコロニーに番号を付けます。番号が付けられていないプレートはランダムで選択・処理されます。液体培養を使用する場合、サンプルを96ウェルプレートに入れ、ストリップキャップを付けて提出してください。寒天プレートをパラフィルムで巻き、損傷の可能性を防ぐため緩衝材を入れます。
ファージ上清** 50 ulのファージ上清を8連PCRチューブまたは1.5 mlマイクロチューブに入れ、サンプル名をはっきりと記してください。
ファージプラーク シーケンシング用に提出するプラークを丸で囲み、番号を付けます。輸送に際しては寒天プレートをパラフィルムで巻き、損傷の可能性を防ぐため緩衝材を入れます。

*注記:発現ベクターはRCAプロトコルには適さない場合もあります。

**注記:RCAは環状ファージに対してのみご利用になれます。線状ファージゲノムは、この方法では増幅できません。

当社のサンプル提出ガイドライン をご覧になり、細菌とファージのテンプレートに関する詳細を確認してください。

注文方法

*同日サービスをご利用になる場合、東部標準時(EST)の午前10時までにサンプルがGENEWIZニュージャージー研究所に届く必要があります。  直接的シーケンシングテンプレートについては、同日サービスはご利用になれません。



 電子メール |  電話 03-6628-2950